胚胎干细胞移植对转化生长因子β1和髓鞘碱性蛋白影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (1): 112-118.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.019

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胚胎干细胞移植对转化生长因子β1和髓鞘碱性蛋白影响

杨建华，张富运，热吉普，申福国，乔建民

佳木斯大学附属第一医院，黑龙江省佳木斯市 154003

修回日期:2013-11-27 出版日期:2014-01-01 发布日期:2014-01-01
通讯作者: 乔建民，主任医师，教授，硕士生导师，佳木斯大学附属第一医院，黑龙江省佳木斯市 154003
作者简介:杨建华，男，1969年生，黑龙江省佳木斯市人，汉族，硕士，副主任医师，硕士生导师，主要从事干细胞在中枢神经系统的损伤研究。
基金资助:
黑龙江省自然科学基金(D201160)；黑龙江省教育基金(12511539)；黑龙江省卫生厅资助(2010-521)；佳木斯大学校基金

Embryonic stem cells transplantation effects on expression of transforming growth factor beta 1 and myelin basic protein

Yang Jian-hua, Zhang Fu-yun, Re Ji-pu, Shen Fu-guo, Qiao Jian-min

First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjiang Province, China

Revised:2013-11-27 Online:2014-01-01 Published:2014-01-01
Contact: Qiao Jian-min, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjiang Province, China
About author:Yang Jian-hua, Master, Associate chief physician, Master’s supervisor, First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. D201160; the Educational Foundation of Heilongjiang Province, No. 12511539; the grant from Heilongjiang Health Bureau, No. 2010-521; the grant from Jiamusi University

摘要/Abstract

摘要：

背景：多项研究证实胚胎干细胞诱导的神经前体细胞能够促进脊髓损伤大鼠功能的恢复。
目的：观察胚胎干细胞经体外诱导培养的神经前体细胞在脊髓损伤大鼠中的作用。
方法：144只大鼠随机分为3组，实验组和对照组建立大鼠脊髓全横断模型，实验组造模后在椎管内损伤区上下两端注射胚胎干细胞衍生细胞；对照组于相同部位注射PBS；假手术组仅行椎板切除，不损伤脊髓，不做其他处理。
结果与结论：对照组和实验组大鼠造模后21 d后，对照组脊髓损伤区域转化生长因子β1表达显著高于实验组(P < 0.05)。各时间点实验组大鼠脊髓中髓鞘碱性蛋白表达量显著高于对照组(P < 0.05)。细胞移植后各时间点实验组BBB评分明显优于对照组(P < 0.05)。提示胚胎干细胞培养诱导分化为神经前体细胞移植后期可降低转化生长因子β1的表达，并可以提高髓鞘碱性蛋白的表达变化，有助于大鼠全横断脊髓损伤的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 干细胞移植, 髓鞘碱性蛋白, 转化生长因子β1, 细胞移植, 脊髓损伤, 免疫组织化学, RT-PCR, 黑龙江省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Several studies have demonstrated embryonic stem cells induced neural precursor cells can promote functional recovery in rats with spinal cord injury.
OBJECTIVE: To study the effect of in vitro cultured embryonic stem cells induced neural precursor cells in rats with spinal cord injury.
METHODS: Totally 144 rats were randomly divided into three groups. Experiment group and control group rats had spinal cord transection injury. Embryonic stem cells-derived cells were injected into the vertebral canal at rostral and caudal segment perilesionally for the experiment group whereas PBS solution was injected instead of cells in the control group. Sham surgery group rats had only laminectomy without any spinal cord injury and treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: The experimental result showed that at day 21 post-injury, the regional expression of transforming growth factor-β1 was greater in rats from the control group in comparison to the experiment group (P < 0.05). At each time point after spinal cord injury in rats, the expression of myelin basic protein in the spinal cord was significantly higher in the experiment group than the control group (P < 0.05). After cell transplantation, Basso, Beattie, and Bresnahan scores of the experiment group at different time points were significantly higher than those of the control group (P < 0.05). Transplantation of in vitro cultured embryonic stem cells induced neural precursor cells can reduce the late expression of transforming growth factor-β1, and can increase the expression of myelin basic protein which contributes to the recovery of rats with completely transected spinal cord injury.

全文链接：

Key words: stem cells, embryonic stem cells, transforming growth factor beta1, cell transplantation

中图分类号:

R394.2

杨建华，张富运，热吉普，申福国，乔建民. 胚胎干细胞移植对转化生长因子β1和髓鞘碱性蛋白影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(1): 112-118.

Yang Jian-hua, Zhang Fu-yun, Re Ji-pu, Shen Fu-guo, Qiao Jian-min . Embryonic stem cells transplantation effects on expression of transforming growth factor beta 1 and myelin basic protein[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(1): 112-118.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 纳入动物数量为144只，96只进行造模，造模成功率为100%，2只大鼠死亡，1只为麻药过量，1只为造模后感染死亡，死亡后均给予补充。共144只大鼠进入结果分析。

2.2 胚胎干细胞形态学观察 胚胎干细胞经体外诱导培养后，在显微镜下见类胚体周边生长出纤维状细胞，核质比较大，紧密排列(图1 A，B)。而在含有LIF的胚胎干细胞培养液和胎鼠成纤维细胞的情况下，胚胎干细胞却保持未分化状态，克隆生长良好，呈圆形或椭圆形的小集落生长，小集落边缘光滑并明亮，胞体体积较小，细胞核较大，有1个甚至多个核仁(图1C)。

2.3 免疫组织化学染色后各组大鼠脊髓内灰度值的表达变化 转化生长因子β1蛋白免疫组织化学染色后示：在移植后7，14 d时假手术组、对照组、实验组的灰度值比较无差别(P > 0.05)。在移植后 21 d，实验组的灰度值显著大于对照组(P < 0.05)，但对照组与假手术组比较无差别(P > 0.05)。而在术后28 d时假手术组、对照组、实验组的灰度值比较无差别(P > 0.05) (图2A，表1)。

髓鞘碱性蛋白免疫组织化学染色后显示：在各时间点实验组灰度值低于对照组(P < 0.05)，且对照组低于假手术组(P < 0.05)(图2B，表1)。

2.4 RT- PCR检测结果

转化生长因子β1：造模后 21 d，对照组的大鼠脊髓组织中转化生长因子β1相对A值表达大于实验组，而对照组与假手术组无差别。造模后7，14，28 d，3组大鼠脊髓组织中转化生长因子β1相对A值表达无差异(P > 0.05)(图3，表2)。

髓鞘碱性蛋白：在7，14，21，28 d各时间点实验组大鼠脊髓组织中髓鞘碱性蛋白相对A值与对照组比较明显较高(P < 0.05)。且对照组大鼠脊髓组织中髓鞘碱性蛋白相对A值与假手术组比较明显较高(P < 0.05) (图3，表2)。

2.5 后肢运动功能评分 造模前所有的大鼠进行BBB评分均为21分。大鼠在造模6 h之后全部完全清醒，所有脊髓全横断鼠都出现了典型的截瘫综合征；伴有腹胀、尿潴留、排便困难等症状。造模后各时间点所有大鼠BBB 评分全部小于造模前，差异有显著性意义(P < 0.05)；造模后14，21，28 d各时间点间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。对照组大鼠在检测时间内下肢功能完全丧失，肌力零级，后肢运动功能均为0分。造模后 7 d，实验组大鼠后肢功能开始恢复，造模后 14，21，28 d，实验组后肢评分高于对照组(P < 0.05)。假手术组各时间点双侧后肢运动功能均为21分，高于造模后实验组、对照组(P < 0.05) (表3)。

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引言

材料方法

设计：完全随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年3至8月在佳木斯大学动物中心实验室和基础医学院生化实验室和病理科完成。

材料：

实验动物：SPF级健康8周龄Wistar雌性大鼠144只，体质量180-220 g，由佳木斯大学动物中心提供，大鼠适应性喂养1 周后进行实验。

自制胚胎干细胞培养液：含高糖DMEM、体积分数15%胎牛血清、0.5%青霉素/链霉素、1%非必需氨基酸、1 000 U/mL LIF、BME。

实验方法：

胚胎干细胞的培养与诱导：将装有胚胎干细胞的冻存管在37 ℃水浴中震荡(1 min)至细胞悬液解冻，将细胞悬液置于铺有饲养层的培养皿上。加入5 mL胚胎干细胞培养液，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。经三四次传代后，2.5 g/L胰酶消化成单细胞，加入胎牛血清终止消化。在1 000 r/min，10 min情况下，诱导培养液重悬(吹打混匀)，并接种于培养皿中，在避光条件下37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱培养5 d，得到类胚体，之后收集接种于明胶包被的培养皿中。采用贴壁诱导培养液继续诱导培养，此后每2 d换液1次。

细胞收集及形态观察：在培养9 d后，用0.05%胰酶消化细胞，加入胎牛血清终止消化，并用350目的滤网过滤细胞，置于50 mL离心管中，再次1 000 r/min离心，共 10 min。用含体积分数0.5%胎牛血清的PBS洗涤2次，计数细胞活性> 95%。最终细胞浓度控制在3×10¹⁰ L^-¹以上，收集细胞为胚胎干细胞的衍生细胞。于倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长情况。

脊髓全横断模型的制作：随机取96只大鼠用体积分数10%水合氯醛溶液，按3 mL/kg腹腔注射，等待麻醉满意后，俯卧固定，碘伏消毒术区，取脊背部正中切口长约1.5 cm。手术刀切开皮肤及皮下筋膜，分离棘突两旁肌肉，暴露脊柱棘突及椎板，剪刀剪除T₉_-₁₀椎板并打开椎管，充分暴露脊髓后侧，用手术刀片将T₁₀脊髓完全横断直至可触及椎体的后侧，确保脊髓已被完全横断，逐层缝合至皮肤，对皮，用生理盐水冲去切口及其周围血迹，无菌纱布擦干切口，制成脊髓完全横断模型。另取48只大鼠为假手术组：行椎板切除后，对脊髓不损伤，逐层缝合肌肉与皮肤。造模后7 d内每天给大鼠腹腔注射青霉素防止感染，每日分别于上下午2次用手挤压膀胱、结肠与直肠帮助排尿排便，直到自身排尿和排便反射恢复。对摄食、饮水不给与干预。

实验动物分组：144只大鼠被分为3组，假手术组；对照组：脊髓T₁₀被完全横断损伤模型建立后，在椎管内损伤区上下两端注射PBS；实验组：脊髓全横断损伤模型后，向椎管内损伤区上下两端注射胚胎干细胞衍生细胞。3个组按存活时间不同分为7，14，21和28 d组，每个时间点12只动物。

细胞移植：实验组打开椎管暴露脊髓后，将配制好的含3×10¹⁰ L^-¹胚胎干细胞衍生细胞2.0-3.0 μL分别注射到脊髓横断处近远两端约1 cm的椎管内，约5 min内注完。对硬脊膜不做任何处理，仅缝合肌肉、筋膜及皮肤，移植的胚胎干细胞衍生细胞存在脊髓横断处远近两端。对照组大鼠注射同等量的PBS。假手术组不做处理。

免疫组织化学染色检测：于细胞移植后7，14，21，28 d行为学观察后，各组取6只，在麻醉情况下打开胸腔，心脏左心室插管，剪开右心耳，先灌注生理盐水约200 mL，再用约300 mL的40 g/L多聚甲醛灌注固定，剥除脊髓被膜。取出以损伤脊髓平面为中心的脊髓组织(包括损伤头、尾侧各约4 mm脊髓)，假手术组大鼠在灌注后取出对应部位脊髓组织。石蜡包埋，常规连续切片，厚度为4 μm，染色按SABC染色试剂盒说明书操作，一抗(兔抗大鼠转化生长因子β1、髓鞘碱性蛋白多克隆抗体)的稀释度为1∶100，最后用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，脱水，透明，封固。每个标本取3张切片，在显微镜下观察，对每个切片选取4个区域，用每个切片染色强度的灰度值平均值显示转化生长因子β1、髓鞘碱性蛋白表达量。

RT-PCR检测：动物到达存活时间点后，各组取6只大鼠，待麻醉后，用0.1%DEPC水浸泡、再用高压蒸灭菌的手术器械，将椎管打开暴露脊髓，取出损伤的脊髓组织(包括损伤两侧各约5 mm脊髓)，用预先准备好的4 ℃ DEPC 处理水冲洗2次，洗去包围在组织上的血迹。再置于加入含有1 mL TRIZOL裂解液的EP管中，按照TRIZOL试剂盒提取总RNA，之后其浓度用紫外分光光度仪测量。按照RT-PCR 试剂盒说明书合成cDNA ，起始总RNA样品均取4 µg。PCR反应条件：先94 ℃预变性5 min，再94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s延伸反应，40次循环，72 ℃总延伸10 min。凝胶电泳采用Quantity one凝胶成像系统采集和分析。同样的方法来扩增内参管家基因GAPDH。以转化生长因子β1、髓鞘碱性蛋白与内参的灰度值比值为统计目标。

行为学评估：将3组大鼠放在适宜的环境中，首先让大鼠适应环境5 min，所有大鼠进行BBB评分法对其大鼠后肢运动功能进行评分^[3]。观察动物的臀、膝、踝关节、行走步态、躯干运动及其协调情况，记录数值。对造模前和造模后7，14，21，28 d大鼠，每组分别取6只大鼠。所有观察都在上午进行，评价前检查所有动物膀胱是否充盈，避免膀胱充盈从而影响大鼠后肢活动。由熟悉该评分标准的实验人员进行评分。

主要观察指标：观察胚胎干细胞移植后各组大鼠大脊髓损伤区免疫组织化学染色后灰度值的变化情况；RT-PCR检测转化生长因子β1，髓鞘碱性蛋白的表达变化及BBB评分。

统计学分析：由第一作者采用采用 SPSS 17.0软件对数据完成统计处理，组间比较采用独立样本t 检验，检测数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前脊髓损伤的治疗仍然是医学界的一大难题，近些年来这方面的研究已成为生命医学领域的热点之一^[4]。脊髓损伤的病理生理过程分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。继发性损伤是由原发性损伤引发的^[5]。通常原发性损伤被认为是不可逆转的，但作为后者的继发性损伤却是可逆的^[6]。在消除原发性致病因素的同时，有效控制脊髓损伤后继发性损伤的程度，使其降到最低是保护脊髓功能、提高预后效果的关键^[7]。干细胞移植是作为神经疾病治疗较为有效的方法之一^[8-9]。实验通过观察脊髓损伤及移植经体外诱导培养的胚胎干细胞对急性脊髓损伤后继发性损伤的影响，探讨胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞对脊髓损伤的修复作用机制，有望为治疗脊髓继发性损伤在临床上的应用提供更进一步理论依据和新的途径。脊髓损伤后导致了某些神经化学物质的释放、微血管通透性的增加和血管组织的水肿，这在脊髓损伤的病理生理变化中起着重要作用。这种病理生理过程的变化必然会使脊髓损伤后脊髓组织内本身成分的改变。这其中就包括转化生长因子β1和髓鞘碱性蛋白。

转化生长因子β1作为一种多功能的细胞因子，几乎所有类型的细胞(如神经细胞、内皮细胞和结缔组织等)都可以合成转化生长因子β1并可以表达相应的转化生长因子β1受体^[10]。在脊髓损伤组织内，转化生长因子β1是一种能够改变脊髓损伤微环境、诱导和促进脊髓损伤轴突有效修复再生的因子^[11]。在脊髓损伤后，受损伤的神经元可通过提高转化生长因子β1及其受体的表达对神经元起到保护作用，促进轴突生长，而神经胶质细胞表达转化生长因子β1可刺激瘢痕形成^[12]。

有研究发现，正常大鼠中神经细胞转化生长因子β1基本不表达或者是表达甚微，可是神经元受到损伤后转化生长因子β1的表达量迅速上调^[13]。在研究出生后1周和2周脊髓横断后的小鼠，发现3 h-14 d时转化生长因子的表达显著上调^[14]。在体外培养中发现，转化生长因子β1和转化生长因子β2可使生长中的神经元数目增加、并可促进神经元存活及轴突的发生和生长，这对神经组织有良好的神经营养作用^[15]。有研究显示，发现位于胸段的脊髓在开放性损伤时，损伤后的血肿内可出现高浓度的转化生长因子β1^[16]。

上述资料结果表明，在脊髓损伤后转化生长因子β1的表达迅速上调，对脊髓损伤后的早期修复起到了积极的作用、可能是机体的正常调节反应。大量文献证实，中枢神经系统损伤后的神经胶质细胞参与了其损伤后的早期修复反应^[17-18]。脊髓损伤后，转化生长因子β1在脊髓组织中显著提高，起着对吞噬细胞及神经胶质细胞的活化作用，参与血管反应、促进了结缔组织形成、影响细胞内外基质沉积和胶原形成等，从而对脊髓损伤后的修复起到积极作用^[19-21]。而在脊髓损伤后期，神经胶质细胞释放转化生长因子β1能够促进瘢痕形成。有研究证实外源性转化生长因子β1能够对前5 d脊髓损伤后的后肢运动功能有明显的改善作用，但是最终神经功能没有改善，且脊髓损伤后形成的纤维瘢痕更明显，这说明脊髓损伤后期纤维素的免疫活性增强^[22]。

近年来的研究发现用转化生长因子β1抗体局部射入胸段脊髓损伤大鼠体内能有效阻止瘢痕的形成、促进了小胶质细胞活性的上调，最终导致了大鼠神经功能的恢复^[23]。在本实验中，免疫组织化学染色和RT-PCR检测显示胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞移植后21 d，转化生长因子β1在脊髓区的表达量显著下调，提示移植胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞治疗全横断脊髓损伤能够阻止瘢痕的形成，为脊髓损伤修复的过程创造较为良好的周围环境。可见胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞移植脊髓全横断损伤大鼠能在损伤后期减少转化生长因子β1的表达，降低脊髓损伤后期瘢痕的形成，从而起到对脊髓损伤功能的恢复作用。表明胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞移植脊髓损伤大鼠后，脊髓损伤后期脊髓组织内转化生长因子β1的表达下降与脊髓功能的恢复可能存在一定的联系。

一般说来，脊髓损伤后，损伤神经组织再生或芽生仍可以见到。但是，因为脊髓损伤后周围环境中出现很多不利因素(瘢痕形成、营养因子和抑制因子表达的变化等)使轴突再生或芽生的距离十分的有限，很难越过损伤的部位与剩余的或未受损伤的神经组织形成有功能性的突触，对脊髓损伤后神经功能的恢复产生了严重的影响。由于脊髓损伤后自发性轴突再髓鞘化非常有限，脊髓损伤后的细胞移植治疗被看作是促进轴突再髓鞘化的非常重要方法，因此，最大限度加快神经组织的髓鞘化，控制脊髓损伤后微环境的变化对脊髓损伤的治疗有重要意义。

少突胶质细胞(OL)是位于中枢神经系统髓鞘重要细胞，髓鞘碱性蛋白是脊椎动物中枢神经系统少突胶质细胞合成的强碱性膜蛋白、是中枢神经系统髓鞘的主要结构蛋白^[24]，是维持神经元髓鞘结构完整和功能稳定中起到重要作用，其主要生理功能是通过与髓鞘膜带负电荷的磷脂在髓鞘浆膜面的相互作用，促使少突胶质细胞质面融合而成多层膜结构的主要致密线维持鞘的紧密性，而且在髓鞘形成过程中具有启动作用。

髓鞘碱性蛋白作为特异性标记物被广泛应用于髓鞘及相关疾病研究^[25]。脊髓损伤后神经纤维髓鞘的破坏和丢失导致了中枢神经系统的电传导阻滞，进而导致运动功能障碍，其破坏的严重程度也是对功能丧失程度的重要原因^[26]。研究显示，髓鞘化水平的程度可以用髓鞘碱性蛋白的含量高低来评估^[27-29]，髓鞘形成或再生时说明髓鞘碱性蛋白表达上调，髓鞘脱失或形成不良时则说明髓鞘碱性蛋白表达降低。

实验免疫组织化学染色及RT-PCR检测结果反映，脊髓损伤7 d后髓鞘碱性蛋白的表达上调，实验组与其他两组相比较，脊髓损伤恢复情况较好。作者认为这可能与胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞在脊髓损伤后改善损伤组织周围微环境有关，从实验中发现实验组髓鞘碱性蛋白含量显著高于模型组，表明局部注射胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞可以提高损伤脊髓组织内髓鞘碱性蛋白，促进脊髓损伤部位轴突的再生与髓鞘化，有利于损伤脊髓神经功能恢复。

对于脊髓损伤及其损伤后治疗的实验研究来讲，神经功能恢复的正确评价是一个重要内容，它对试验结果的判断有着很大的影响。目前对于脊髓神经功能恢复及其功能的评价方法通常有后肢运动功能、脊髓电生理等方法。后肢运动功能评分在这些方法之中最为常用，也最为方便及客观。BBB评分是目前较为常见的后肢运动功能评分标准，能准确的反映后肢运动功能情况。

实验中采用BBB评分方法能够很好的反映出经细胞移植治疗后大鼠后肢运动功能的恢复。各时间点假手术组评分为21分，对照组评分为0分，随时间延长，实验组评分逐渐增加，可见实验组后肢评分高于对照组，提示胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞移植对脊髓损伤大鼠能够促进损伤功能的恢复。这可能与脊髓损伤区域转化生长因子β1和髓鞘碱性蛋白的表达变化有关。

综上所述，胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞移植对脊髓损伤大鼠的后肢功能有改善作用，机制之一可能与局部注射胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞使脊髓组织中转化生长因子β1晚期表达下调及髓鞘碱性蛋白的表达上调有关。但脊髓损伤的过程非常复杂，是多种因素共同参与的结果，脊髓组织中转化生长因子β1和髓鞘碱性蛋白的表达变化是否是胚胎干细胞在体外经诱导的神经前体细胞移植改善脊髓损伤大鼠后肢功能的主要作用机制还有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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胚胎干细胞移植对转化生长因子β1和髓鞘碱性蛋白影响

Embryonic stem cells transplantation effects on expression of transforming growth factor beta 1 and myelin basic protein

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